Курсова робота Молекула фібриногену та дослідження полімеризації фібрину за допомогою моноклональних антитіл
Код роботи: 5338
Вид роботи: Курсова робота
Предмет: Біохімія
Тема: Молекула фібриногену та дослідження полімеризації фібрину за допомогою моноклональних антитіл
Кількість сторінок: 36
Дата виконання: 2016
Мова написання: українська
Ціна: 350 грн
Вступ
1. Будова та властивості молекули фібриногена
2. Активація фібриногену тромбіном та молекулярний механізм полімеризації фібрину
3. Розщеплення плазміном фібринового згустку
4. Дослідження полімеризації фібрину за допомогою моноклональних антитіл
4.1. Розчинний фібрин та кількісне визначення його ранніх форм в плазмі крові
4.2. D-димер та його кількісне визначення в плазмі крові
4.3. Протеїн С та його кількісне визначення в плазмі крові
Висновок
Список літератури
Багато захворювань людини, такі як: ішемічна хвороба серця, венозний тромбоемболізм, ДВЗ-синдром, ішемічний інсульт та багато інших, супроводжуються аномальною активацією системи зсідання крові центральним білком якої є фібриноген. Порушення рівноваги між системами зсідання та антикоагуляційною системою крові лежить в основі патогенеза багатьох захворювань. Пов’язано це, як правило, з недостатністю кровопостачання критичного органа й пригнічення його функціональної активності. До числа найбільш відомих патологій такого роду відносяться захворювання серцево-судинної системи та деякі інфекційні хвороби.
Зусилля спеціалістів провідних наукових центрів та біотехнологічних фірм світу спрямовані на пошук нових субстанцій й розробку препаратів, аналогічних ендогенним речовинам. Ефективними для подальшого використання виявляються речовини, отримані як у результаті хімічного синтезу (пептиди; похідні індола, імідазола, піридина), так і отримані монАТ проти ділянок фібрин(оген)а, які відповідають за його полімеризацію.
Для діагностики захворювань системи гемостазу, а також для моніторингу ефективності їх лікування важливе значення має кількісне визначення в плазмі крові людини концентрації молекулярних маркерів, що характеризують стан даної системи. Одними із таких важливих маркерів є протеїн С, розчинний фібрин та D-димер.
Розчинний фібрин являє собою комплекси та олігомери фібрину desA з фібриногеном. У молекулі фібрин(оген)у умовно розрізняють центральний регіон Е, два периферійних регіони D та αС-регіони, які являють собою 2/3 С-кінця його Аα-ланцюга. В процесі фібринолізу плазмін в першу чергу відщеплює αС-регіони від молекули фібрина. Визначення кількості ранніх форм розчинного фібрина, в якому присутні αС-регіони, дасть можливість діагностувати загрозу тромбоутворення на початковий її стадії.
Підвищення рівня розчинного фібрина являється раннім прогностичним показником активації системи зсідання крові. Одночасне визначення його вмісту з рівнем D-димера в плазмі крові може констатувати наявність чи відсутність балансу та кореляції між накопиченням розчинного фібрина і його деградацією. У зв'язку з цим, в клінічній практиці кількісного визначення розчинного фібрина і D-димера, яке забезпечується тільки іммуноферментним аналізом, повинно входити в обов'язковий алгоритм діагностики протромботичних станів і тромбоза глибоких вен.
Протеїн С є глікопротеїном з молекулярною масою 62 кДа, синтезується головним чином в печінці та циркулює в плазмі крові за норми в концентрації 4 мкг/мл. Вроджена недостатність протеїну С є однією з причин повторних тромбоемболій. Набута недостатність протеїну С може спостерігатися, напрклад, при ДВЗ-синдромі, коли зниження концентрації протеїну С відбувається за рахунок його активації та утворення комплексу з інгібітором, а також виникати, наприклад, при пошкодженнях печінки, гострій лейкемії, при післяопераційних станах, респіраторному дистрес-синдромі, цукровому діабеті 1 типу, продукуванні антифосфоліпідних антитіл, наявності ліпопротеїнів низької щільності, недостатності вітаміну К, лікуванні антикоагулянтами тощо. При зниженій концентрації протеїну С відмічається схильність до тромбофілії, а саме тенденція до розвитку тромбозів, тромбофлебітів та тромбоемболій. Таким чином ступінь пониження концентрації протеїну С позитивно корелює зі ступенем ризику тромбоутворення та є важливим діагностичним показником.
У данному рефераті було описано центральний білок системи зсідання крові - фібриноген, його активація тромбіном, молекулятний механізм полімеризації фібрину та розщеплення плазміном фібринового згустку. Разом з тим у роботі іде річ про хвороби, що викликані аномальною активацією системи зсідання крові та важливі молекуляні маркери, що свідчать про загрозу тромбоутворення.Основна увага була приділена методам кількісного визначення в плазмі крові цих маркерів за допомогою тест-систем, що працють на основі моноклональних антитіл.
Одним з таких методів являється кількісне визначення розчинного фібрина в плазмі крові за допомогою антитіл проти aC – регіону молекули фібрин(оген)а. Розчинний фібрин являє собою комплекси та олігомери фібрину desA з фібриногеном. У молекулі фібрин(оген)у умовно розрізняють центральний регіон Е, два периферійних регіони D та αС-регіони, які являють собою 2/3 С-кінця його Аα-ланцюга. В процесі фібринолізу плазмін в першу чергу відщеплює αС-регіони від молекули фібрина.
У роботі підкреслено що саме визначення кількості ранніх форм розчинного фібрина, в якому присутні αС-регіони, дасть можливість діагностувати загрозу тромбоутворення на початковий її стадії. До данного методу раніше були отримані моноклональні антитіла І-5В та І-6В, що потребують більш детальної характеристики. Однак, у роботі ставиться наголос на тому, що більш точним і корректнішим буде визначення кількості розчинного фібрина одночасно з D-димером. Інформація о корреляції між змінами концентрацій D-димера та розчинного фібрина важлива для встановлення порушення рівноваги між системами зсідання крові і фібриноліза та визначення ступеня загрози тромбоутворення.
Також був описаний другий метод, що засновується на кількісному визначенні протеїну С, що є ключовим проферментом фізіологічного механізму антикоагуляції. Відомо, що при низькій концентрації протеїну С підвищується загроза тромбоутворення, тому цей білок являється одним з найважливіших молекулярних маркерів передтромботичних станів. Було зазначено, що шляхом біоінформатичного аналізу співробітниками відділа структури і функції білка Інституту біохіміі ім О.В. Палладіна та партнерами було визначено амінокислотні послідовністі в молекулі протеїну С, які мають мінімальну гомологію з послідовностями інших білків плазми крові та до яких може виникати імунна відповідь, і синтезовано пептид, який відповідає одній з цих послідовностей з метою створення коньюгату для імунізації мишей. В подальшому були отримані моноклональні антитіла проти протеїну С, які надалі потебують детальної характеристики.
Список літератури
1. Yu S., Sher B., Kudryk B., Redman C.M. Fibrinogen precursors. Order of assembly of fibrinogen chains // J. Biol. Chem. – 1984. – Vol. 259, N 16. – P.10574-10581.
2. Blomback B. Fibrinogen and fibrin formation // Plasma proteins. Edited by B. Blomback, L. A. Hanson. - John Wiley & Sons. Chichester, New York, Brisbane, Toronto. - 1979. - P. 223-253.
3. Collen D., Tytgat G. N., Claeys H., Piessens R. Metabolism and distribution of fibrinogen. I. Fibrinogen turnover in physiological conditions in humans // Br. J. Haematol. – 1972. – Vol. 22, N 6. - P. 681-700.
4. Doolittle R. F. The structure and evolution of vertebrate fibrinogen // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1983. – Vol.408. – P. 13-27.
5. Watt K. W., Takagi T, Doolittle R. F. Amino acid sequence of the - chain of human fibrinogen: homology with the - chain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1978. – Vol. 75, N 4. – P. 1731-1735.
6. Blomback B., Grondahl N. J., Nessel B., Iwanaga S. and Wallen P. Primary structure of fibrinogen and fibrin // J. Biol. Chem. - 1973. – Vol. 248, N 16. - P. 5806-5820.
7. Townsend R. R., Hilliker E., Li Y. T., Laine R. A., Bell W. R., Lee Y. C. Carbohydrate structure of human fibrinogen. Use of 300-MHz 1H-NMR to characterize glycosidase-treated glycopeptides // J. Biol. Chem. – 1982. – Vol. 257, N 16. - P. 9704-9710.
8. Brown J., Volkmann N., Jun G., Henschen-Edman A., Cohen C. The crystal structure of modified bovine fibrinogen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. – Vol. 97, N 1. - P. 85-90.
9. Doolittle R. F., Watt K. W., Cottrell B. A., et al. The amino acid sequence of the alpha-chain of human fibrinogen // Nature. – 1979. – 280. – P. 464-468.
10. Tsurupa G., Tsonev L., Medved L. Structural organization of the fibrin (ogen) C-domain // Biochemistry. – 2002. – Vol.41, N 20. – P. 6449-6459.
11. Spraggon G., Everse S. J., Doolittle R. F. Crystal structures of fragment D from human fibrinogen and its crosslinked counterpart from fibrin // Nature. - 1997. – 389. - P.455-462.
12. Madzaro J., Brown J. H., Litvinovich S., Dominguez R., Yakovlev S., Medved L., Cohen C. Crystal structure of bovine fibrinogen (E5 fragment) at 1.4 Å resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – Vol. 98, N 21. – P. 11967-11972.
13. Yang Z., Kollman J. K., Pandi L., Doolittle R. F. Crystal structure of native chicken fibrinogen at 2.7Å resolution // Biochemistry. – 2001. – Vol. 40, N 42. – P. 12515-12523.
14. Луговской Э. В. Молекулярные механизмы образования фибрина и фибринолиза. // Киев, Наукова думка – 2003. – с. 89-96.
15. Dang Ch. V., Shin C. K., Bell W. R. Nagaswami C., Weisel J. Fibrinogen sialic acid residues are low affinity calcium-binding sites that influence fibrin assembly // J. Biol. Chem. - 1989. – Vol. 264, N 25. - P. 15104-15108.
16. Everse S. J., Spraggon G., Veerapandian L., Doolittle R. F. Conformational changes in fragment D and double - D from human fibrin(ogen) upon binding the peptide ligand Gly-His-Arg-Pro-amide // Biochemistry. - 1999. – Vol. 38, N 10. - P. 2941-2946.
17. Chung D. W., Davie E. W. and chains of human fibrinogen are produced by alternative mRNA processing // Biochemistry. – 1984. – Vol. 23 – P. 4232-4236.
18. Wolfenstein-Todel C., Mosseson M. W. Carboxyterminal amino-acid sequence of a human - chain variant // Biochemistry. - 1981. – Vol.20, N 21. - P.6146-6149.
19. Lorand L. Factor XIII: structure, activation, and interactions with fibrinogen and fibrin // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2001. – Vol. 936. – P.291-311.
20. Fu J., Grininger G. Fib420: A normal human variant with two extended - chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. – Vol.91. - P. 2625-2628.
21. Grieninger G. Contribution of the EC domain to the structure and function of fibrinogen - 420 // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2001. – Vol. 936. – P. 44-64.
22. Spraggon G., Applegate S. J., Everse S. J. et al. Crystal structure of a recombinant EC domain from human fibrinogen-420 // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. – 1998. – Vol.95. – P. 9099-9104.
23. Hanss M., Biot F. A database for human fibrinogen variants // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2001. - 936. – P. 89-90.
24. Matsuda M., Sugo T. Hereditary disorders of fibrinogen // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2001. - 936. – P. 65-88.
25. Herrick S., Blanc-Brude O., Gray A., Laurent G. Molecules in focus: Fibrinogen // The International Journal of Biochemistry&Cell Biology (IJBCB). – 1999. – Vol. 31. - P. 741-746.
26. Fenton J. W., II. Regulation of thrombin generation and functions // Semin. Thromb.Haemost. - 1988. – Vol. 14, N 3 - P. 234-240.
27. Blomback B., Blomback M., Nessel B., Iwanaga S. Structure of N-terminal fragments of fibrinogen and specifity of thrombin // Nature. - 1967. – Vol. 215. – P. 1445-1448.
28. Baradet T. C., Haselgrove J. C., Weisel J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching // Biophys. J. - 1995. – Vol. 68. – P. 1551-1560.
29. Laudano A. P., Doolittle R. F. Synthetic peptide derivatives that bind to fibrinogen and prevent the polymerization of fibrin monomers // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. - 1978. – Vol. 75, N 7. - P. 3085-3089.
30. Doolittle R. F., Laudano A. P. Syntetic peptide probes and the location of fibrin polymerization sites // Peptid. Biol. Fluids. - 1980. – Vol.28. - P. 311-316.
31. Lounes K. C., Okumura N., Hogan K. A., Ping L., Lord S. T. Polymerization site "a" function dependence on structural integrity of its nearby calcium binding site // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2001. – Vol. 936. - P. 205-209.
32. Fowler W. E., Hantgan R. R., Hermans J., Erickson H. P. Structure of the fibrin protofibril // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1981. – Vol. 78, N 8. - P. 4872-4876.
33. Yang Z., Mochalkin I., Doolittle R. F. A model of fibrin formation based on crystal structures of fibrinogen and fibrin fragments complexed with synthetic peptides // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2000. - Vol. 97, N 26. - P. 14156-14161.
34. Blomback B, Hessel B, Hogg D, Therkildsen L. A two-step fibrinogen-fibrin transition in blood coagulation // Nature. – 1978. – Vol.275, N. 5680. – P. 501-505.
35. Laudano A. P., Cottrel B. A., Doolittle R. F. Synthetic peptides modeled on fibrin polymerization sites // Ann.N.Y.Acad.Sci. - 1983. –.408. - P. 315-329.
36. Veklich Y. I., Gorkun O. V., Medved L. V., Nieuwenhuizen W., Weisel J. W. Carboxyl terminal portions of the chains of fibrinogen and fibrin – localization by electron microscopy and the effect of isolated C fragments on polymerization // J. Biol. Chem. - 1993. - 268, N 18. – P. 13577-13585.
37. Gorkun O. V., Veklich Y. I., Medved L. V., et al. Role of the C-domains in fibrin formation // Biochemistry. – 1994. – Vol. 33. – P. 6986-6997.
38. Belitser V. A., Manijakov V. Ph., Varetskaja V. Medium-dependent structure modification of reconstituting fibrin // Biochimica Biophysica Acta. – 1971. – Vol. 236, N 3. – P. 546-549.
39. Carr M. E., Hermans J. Size and density of fibrin fibers from turbidity // Macromolecules. – 1978. – Vol. 11, N 1. – P. 46-50.
40. Ryan E. A., Mockros L. F., Weisel J. W., Lorand L. Structural origins of fibrin clot rheology // Biophys. Journal. – 1999. – Vol. 77. - P. 2813-2826.
41. Ferri F., Magatti D., De Spirito M., Arcovito G., Rocco M. Structure and growth kinetics of fibrin gels: a network of thin fibers pervading the entire volume is built before their lateral aggregation can begin // 16th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis in conjunction with the 17th International Fibrinogen Workshop September 08-13, 2002, Munich, Germany (oral presentation session).
42. Blomback B., Okada M., Forslind B., Larsson U. Fibrin gels as biological filters and interfaces // Biorheology. – 1984. – Vol. 21, N 1-2. – P. 93-104.
43. Mosesson M. W., Siebenlist K. R., Amrani D. L. DiOrio J. P. Identification of covalenty linked trimeric and tetrameric D domains in crosslinked fibrin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1989. – Vol. 86, N 4 – P. 1113-1117.
44. Mosesson M. W. Fibrinogen and fibrin polymerization: appraisal of the binding events that accompany fibrin generation and fibrin clot assembly // Blood Coagul. Fibrinolysis. – Takagi T., Doolittle R. F. Amino acid sequence studies on factor XIII and the peptide released during its acrivation by thrombin // Biochemistry. - 1974. – Vol. 13, N 4. - P. 750-756.
45. Takagi T., Doolittle R. F. Amino acid sequence studies on factor XIII and the peptide released during its acrivation by thrombin // Biochemistry. - 1974. – Vol. 13, N 4. - P. 750-756. Chung S. I., Lewis M. S., Folk J. E. Relationships of catalytic properties of human plasma and platelet transglutaminases (activated blood coagulation factor XIII) to their subunit structures // J. Biol. Chem. - 1974. – Vol. 249, N 3. - P. 940-950.
46. Medved L. V., Privalov P. L., Ugarova T. P. Isolation of thermostable structure from the fibrinogen D fragment // FEBS Lett. – 1982. – 146. – P. 339-342.
47. Э. В. Луговской, И. Н. Колесникова, Э. Н. Золотарева и др. Новый сайт полимеризации фибрина // ДАНУ. – 2001 – № 11. – C. 167-170.
48. E. V. Lugovskoi, I. N. Kolesnikova, S. V. Komisarenko et al. Inhibitory properties of monoclonal antibodies to functional fragments of fibrin(ogen) // The XVth International Fibrinogen Workshop, Cleveland. – 1998. – Abstr. 76.
49. E. V. Lugovskoi, P. G. Gritsenko, I. N. Kolesnikova et al. A new site of fibrin polymerization in D-domain of fibrin // XVIth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis in conjunction with the 17th International Fibrinogen Workshop, Munich, Germany. – 2002. – Abstr. 97.
50. Lugovskoi E. V., Makogonenko E. M., Chudnovets S.G. et al. The study of fibrin polymerization with monoclonal antibodies // Biomedical Science. – 1991. – 2. – P. 249-256.
51. Чудновец В. С., Луговской Е. В., Гоголинская Г. К. и др. Выделение N-концевых дисульфидных узлов фибриногена и фибрина человека и фрагменттов полипептидных цепей, входящих в их состав // ДАН СССР. – 1991. – 317, №6. – С. 1496-1499.
52. Луговской Э. В., Чудновец В. С., Макогоненко Е. М. и др. Исследование полимеризации фибрина с помощью моноклональных антител 2d-2a и их Fab-фрагментов. // Укр. биохим. журн. – 1995. – 1. – С. 64-71.
53. Hui K. Y., Haber E., Matsueda G. R. Monoclonal antibodies to a synthetic fibrin-like peptide bind to human fibrin but not fibrinogen // Science. – 1983. – 222. – P. 1129-1132.
54. Э. В. Луговской, В. С. Чудновец, Г. К. Гоголинская и др. Влияние моноклональных антител к N-концевому фрагменту B-цепи фибриногена на полимеризацию фибрина // ДАНУ. – 2001. – № 10. – C. 190-194.
55. Litvinov R. I., Yakovlev S., Tsurupa G., Gorkun O. V., Medved L., Weisel J. W. Direct evidence for specific interactions of the fibrinogen alpha C-domains with the central E region and with each other.// Biochemistry. - 2007. - V. 46. - P. 9133-9142.
56. Tsurupa G, Mahid A, Veklich Y, Weisel J. W, Medved L. Structure, stability, and interaction of fibrin αC-domain polymers // Biochemistry. 2011. - 50, N37.
57. Медведь Л. В., Горкун О. В., Маняков В. Ф., Белицер В. А. αС-домены молекулы фибриногенакак структуры, ускоряющие самосборку фибрина // Молек. Биол. - 1986. - Т.20, в.2. - С. 461-470.
58.Veklich Y. I., Gorkun O. V., Medved, L. V., Nieuwenhuizen W., Weisel J. W. Carboxyl-terminal portions of the alpha chains of fibrinogen and fibrin. Localization by electron microscopy and the effects of isolated alpha C fragments on polymerization // J. Biol. Chem. - 1993. - V. 268. - P. 13577–13585.
59. Lau H. K. Anticoagulant function of a 24-Kd fragment isolated from human fibrinogen A alpha chains // Blood. - 1993. - V. 81. - P. 3277-3284.
60. Gorkun O. V., Veklich Y. I., Medved L. V., Henschen A. H., Weisel J. W. Role of the alpha C domains of fibrin in clot formation // Biochemistry. - 1994. V. 33. - P. 6986–6997.
61. Позняк Т. А., Колесникова И. Н., Макогоненко Е. М. и др. Изменения пространственной ориентации аС-регионов фибрин(огн)а в прцессе его трансформации в полимерный фибрин // ДАН Украины, 2012. - N5. - С. 163-169.
62. Жерносєков Д. Д., Куркіна Т. В. Протеїн С: Механізми функціонування та методи одержання // Біотехнологія, 2008. - №4. – Т.1.
63. Белицер В. А. Домены – крупные, функционально важные блоки молекул фибрина и фибриногена // Биохимия животных и человека. – 1982. – 6. – С. 38-63.
64. Marder V. J., Francis Ch. W. Plasmin degradation of cross-linked fibrin // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1983. – 408. – P. 389-406.
65. Mihalyi E. Kinetics and molecular mechanism of the proteolytic fragmentation of fibrinogen // Ann. N.Y. Acad.Sci. – 1983. – 408. – P. 60-70.
66. Медведь Л. В. Структурная организация молекулы фибриногена // Укр. биохим. журн. – 1985. – 57, № 5. – P. 36-49.
67. Doolittle R. F., Watt K. W., Cottrell et al. The amino acid sequence of the alpha-chain of human fibrinogen // Nature. – 1979. – 280. – P. 464-468.
68. Mills D. A., Karpatkin S. The initial macromolecular derivatives of human fibrinogen produced by plasmin // Biochim. Biophys. Acta. – 1972. – 271, N 1. – P. 163-173.
69. Galanakis D. K., Mosseson M. W. The alpha-chain composition of plasma fibrinogen catabolites // Thromb. Res. – 1979. – 15, N 1/2. – P. 287-289.
70. Горкун О. В. Медведь Л. В. Структурная организация ранних продуктов плазминового гидролиза Х1 и Х2-фрагментов // ДАН УССР. Сер.Б. – 1984. – 3. – C. 57-61.
71. Marder V. J., Francis Ch. W. Plasmin degradation of cross-linked fibrin // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1983. – 408. – P. 389-406.
72. Collet J. P., Lesty C., Montalescot G., Weisel J. W. Dynamic changes of fibrin architecture during fibrin formation and intrinsic fibrinolysis of fibrin-rich clots // J. Biol. Chem. – 2003. – 278, N 24. – P. 21331-21335.